|
|
Produkce a charakterizace lidského inhibitoru C1 a rekombinantních proteinů z Plasmodium falciparum PfMSP3.1 pro strukturní studia
Čápová, Kateřina ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
PfMSP3.1 je jedním z povrchových proteinů intracelulárního parazita Plasmodium falciparum, který způsobuje malárii. Protein v rámci strategie úniku parazita před imunitním systémem lidského hostitele váže jeden z regulátorů systému komplementu - C1 inhibitor. Zjištění přesného místa vazby a jeho strukturální stanovení by napomohlo k pochopení interakce mezi parazitem a hostitelem, která je důležitá pro rozvoj nemoci, a tím i pro návrh možné terapie. V teoretické části práce je přiblížen životní cyklus Plasmodia falciparum, role vývojového stádia parazita zvaného merozoit, jeho povrchových proteinů a s tím i přímo merozoitového povrchového proteinu 3 při napadání červených krvinek parazitem. Dále je v ní stručně popsán systém komplementu, jeho aktivace a regulace. Experimentální část zahrnuje klonování plasmidů pro tvorbu C1 inhibitoru a různých forem povrchového proteinu merozoitu PfMSP3.1, transfekci S2 hmyzích buněk těmito plasmidy, následnou expresi proteinů v S2 buňkách a jejich purifikaci. V druhé polovině experimentální části byly provedeny pokusy o vytvoření komplexů C1 inhibitoru s jednotlivými formami povrchového proteinu merozoitu PfMSP3.1 a krystalizaci tohoto proteinu. Klíčová slova Proteinová exprese, inhibice enzymů, krystalizace proteinů, malárie. komplement, C1 inhibitor
|
|
|
Příprava mutantního serpinu z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
EDEROVÁ, Monika
Do P1 místa serpinu Iripin-1 pocházejícího ze slin klíštěte Ixodes ricinus byla pomocí specifických primerů zavedena bodová mutace zaměňující arginin za tryptofan. Protein obsahující tuto mutaci byl exprimován v chemicky kompetentních buňkách Escherichia coli. Následně byl z těchto buněk extrahován a přečištěn pomocí afinitní a rozměrově-vylučovací chromatografie. Aby byl ověřen dopad zavedené bodové mutace, byla otestována schopnost získaného proteinu tvořit kovalentní komplexy s trypsinem.
|
|
| |
|
|
Analysis of trypsin inhibitor-like cysteine-rich domain-containing peptides (TIL-domain inhibitors) from the tick Ixodes ricinus
PECHOVÁ, Hana
The master thesis deals with the analysis of trypsin inhibitor-like cysteine-rich domain-containing peptides (TIL-domain inhibitors) extracted from salivary glands of a tick Ixodes ricinus. It comprises the initial bioinformatical analysis of TIL-domain containing peptide family from I. ricinus, molecular cloning of the representative protein into expression vector, followed by production of recombinant TIL-domain inhibitor in bacteria. A representative TIL-domain gene is proved for their structure, biochemical properties as well as immunomodulatory and anticoagulation features.
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Příprava expresního systému gama-laktamázy a otestování exprese v E.coli
Magyerková, Monika ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
γ-laktamasa je enzym štěpící pětičlenné laktamové cykly. Jedním z jejích potenciálních substrátů je polyvinylpyrrolidon (PVP). Degradace PVP γ-laktamasou je zkoumána s ohledem na využití v čistírnách odpadních vod. Cílem této práce proto bylo připravit synteticky gen γ- laktamasy z bakterie Comamonas acidovorans a provést jeho klonování do expresního vektoru pET22b. Pro syntézu genu γ-laktamasy byla použita metoda PCA. Sekvence genu γ- laktamasy o délce 1725 bp byla rozdělena do dvou částí (syntonů), které byly syntetizovány samostatně. Po syntéze bylo provedno restrikční štěpení a ligace do vektoru pUC19. Takto připravenými konstrukty byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene DH5α. Po ověření správnosti sekvencí byly oba syntony vyštěpeny restrikčními endonukleasami a spojeny jednokrokovou ligací do plazmidu pET22b. Rekombinantním plazmidem obsahujícím spojené syntony byly transformovány expresní buňky E. coli kmene BL21(DE3)RIL a byla testována exprese rekombinantní γ-laktamasy. Sekvence klonu produkujícío protein odpovídající délky byla potvrzena sekvenční analýzou. Připravený expresní plazmid bude použit pro produkci rekombinantní γ-laktamasy. (In Czech)
|
|
|
Inducibilní expresní systémy a jejich využití ve studiu parazitických organismů.
Horáčková, Vendula ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
1 Abstrakt Inducibilní expresní systémy jsou systémy, které umožňují ‚zapínat' a ‚vypínat' expresi genu zájmu, a jsou tedy užitečným nástrojem pro studium funkce genů. Existují desítky různých inducibilních expresních systémů, které se navzájem liší úrovní, na které k indukci dochází, dobou indukce, možnostmi využití atd. V této práci budou popsány tři typy inducibilních expresních systémů, na kterých budou demonstrovány obecné rysy systémů regulovaných na úrovni transkripce. Jsou to systémy založené na regulaci lac operonu Escherichia coli, dále systémy využívající regulačních elementů transpozonu Tn10 E. coli, které jsou zodpovědné za rezistenci vůči tetracyklinu, a nakonec systémy regulované agonisty receptoru pro steroidní hormon ekdyson, který je klíčovým regulátorem vývoje hmyzu. Práce obsahuje i kapitolu o využití inducibilních expresních systémů u parazitických organismů.
|
|
|
Optimalizace exprese fotoaktivovatelných cytochromů P450 jako nano-sond pro studium membránové topologie enzymů metabolismu léčiv a aktivace karcinogenů
Smolová, Jana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cytochromy P450 patří mezi jedny z nejdůležitějších enzymů podílejících se na biotransformaci cizorodých látek v organismu. Jsou součástí tzv. moooxygenasového systému, ve kterém interagují s dalšími enzymy - NADPH:cytochrom P450 reduktasou a cytochromem b5. Vzájemné interakce enzymů v mooxygenasovém systému nejsou zcela rozřešeny. K objasnění možných protein-proteinových interakcí a jejich důsledků by mohla přispět technika kovalentního síťování. Jednou z možností realizace tohoto záměru je využití fotoaktivovatelného cytochromu P450, který by po expozici UV záření vytvořil kovalentní komplex se složkami monooxygenasového systému, s nimiž je v kontaktu. Tato práce se proto zabývá vypracováním optimálních podmínek pro produkci rekombinantního cytochromu P450 2B4 s cílem získat poznatky pro produkci fotoaktivovatelného cytochromu P450 s inkorporovanými aminokyselinami L-fotomethioninem a L- fotoleucinem. V provedených experimentech byl cytochrom P450 2B4 exprimován ve dvou kmenech Escherichia coli, C41 (DE3) a BL21 (DE3) Gold, a ve dvou kultivačních nádobách, skleněné Erlenmayerově baňce a plastové Fernbachově baňce. V průběhu exprese byla měřena optická denzita bakteriální suspenze (absorbance při 600 nm) a koncentrace cytochromu P450. Byla vypracována metodika stanovení koncentrace cytochromu P450...
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Study of the variations in the expression of different adhesion and cytoskeletal proteins of podocytes (E-Cadherin, Podocin, Vimentin) due to Bisphenol A
Chvojanová, Zuzana ; Kovařík, Miroslav (vedoucí práce) ; Němečková, Ivana (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biologických a lékařských věd The University of Alcalá, Faculty of Medicine, Department of biomedicine and biotechnology Student: Zuzana Chvojanová Školitel: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Konzultant: María Isabel Arenas Jimenéz Název diplomové práce: Studie změn v expresi různých adhezivních a cytoskeletálních proteinů podocytů (E-kadherin, Podocin, Vimentin) v důsledku Bisfenolu A Bisfenol A (BPA) patří mezi nejrozšířenějsí sloučeniny na světě, jehož produkce činí ročně vice než 6 miliard tun. Je široce používaný jako součást polykarbonátových plastů a epoxidových pryskyřic, z nichž jsou vyráběny znovu použitelné plastové lahve, potravinové boxy a některé lékařské vybavení. Také se používá k potažení vnitřní vrstvy plechovek. V dříve provedených studiích bylo zjištěno, že BPA v lidském organismu přispívá ke vzniku mnoha chronických onemocnění jako například onemocnění ledvin - diabetická nefropatie. Podocyty - terminálně diferenciované buňky Bowmanova pouzdra glomerulu - jsou nedílnou součástí filtrační bariéry, kde hrají důležitou roli v zabránění průniku plasmatických proteinů do moči. Proto jsme se v této studii zaměřili na efekt BPA právě na tyto buňky a jejich konkrétní proteiny, a to pomocí in vivo a in vitro metod....
|
host ::
RSS.